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Was ist zu tun um ein moderner Spektroskopiker zu werden?:

Es ist viel erneut zu lernen - Also last uns beginnen:

Lektion 1: Das “Allgemeine Beer-Lambert Gesetz”:

1. Das Beer-Lambert Gesetz^[1] ist aktueller als jemals zuvor, nur wird es selbst heute noch von der überwiegenden Mehrheit der Spektroskopikern weder beachtet, geschweige den befolgt oder gar korrekt angewendet.
   Das Gesetz ist allzeit gültig !!! — ausser in seinen äussersten Extremen !!! Wenn Du selbst oder jeder andere Spezialist glaubt/überzeugt ist, dass eine Substanz oder Lösung nicht mehr länger dem Gesetz von Beer-Lambert gehorcht, glaube es ausnahmslos keinem !!!
   Denke zuerst nach, was du möglicherweise nicht beachtet hast, welchem spektroskopischen Umstand du nicht Rechnung getragen hast!   Doch um zu verstehen von was ich rede, musst du zuerst lernen in Spektren zu denken und nicht in einer einzelnen Wellenlänge. Dies ist zu Beginn äusserst schwer!   — Ich habe noch nie einen Spektroskopiker gesehen mit einzelnen Wellenlängen in seinen Lösungen; absolut jeder hatte Substanz (Gas, ...) gelöst in seiner Küvette und das heisst Spektren !!!!       Es ist höchste Zeit dies zu lernen !!!
   (Es war uns in all den Jahren nie möglich, einen realen Fall zu finden, wobei eine Lösung nicht strikt dem Gesetz von Beer-Lambert gehorchte! In jedem Falle fanden wir schlussendlich, welchen “spektroskopischen Effekt” — wir nicht genügend berücksichtigt hatten. Aber mit “spektroskopischen Effekt” sind nicht die “Pseudo Korrelationen” gemeint, welche versuchen eine Einwellenlängenmessung mit einem “physikalischen Effekt” in Zusammenhang zu bringen, wie es unzählige Male in der allgemeinen Literatur erfolgt ist !)
   
2. Führe die nächsten vier Schritte mit möglichst viel Diplomatie und entsprechender Vorsicht durch !!
3. Frage deinen Spektroskopiker wie viele Liter Alkohol (Ethanol u. Methanol) er normalerweise innerhalb eines Jahres benötigt um seine Messlösungen zu erstellen.
4. Nun frage ihn, speziell wenn er sagt , dass er meistens in Wasser misst, wieviel Liter Wasser er schätzt, dass er in einem Jahr benötigt um seine Messlösungen für das Spektrometer zu präparieren.
5. Nun, wenn du dich immer noch getraust, frage ihn zum Schluss, wieviel Liter Buffer (Für's erste ist es nicht von Bedeutung welchen Buffer er verwendet. Auch eine starke Säure oder eine starke Base soll als Buffer gelten) er im Laufe eines Jahres verbraucht
6. Zum eigentlichen Schluss zähle die Menge Alkohol, die Menge Wasser, und die Menge Buffer zusammen und bestimme den prozentualen Anteil Buffer am Total. Nun ist es höchste Zeit darüber nachzudenken, ob der Anteil Buffer genügend gross erscheint, wenn wir eigentlich wissen, dass jede Substanz welche im visible Bereich absorbiert einen schlechteren oder besseren Indikator darstellt! Aber auch sehr viele Pharmaprodukte zeigen eine nicht zu vernachlässige pH-Abhängigkeit!
7. Was haben wir gelernt von den vergangenen vier Schritten?
   Benütze — wenn immer möglich, und es ist fast immer und überall möglich, eine Lösungsmittel mit einem Buffer gemischt zum präparieren der Messlösungen!!! Wenn du ein Problem hast, dass der Buffer mit deinem Lösungsmittel "ausfällt" - sende mir ein Mail und ich gebe dir meine Erfahrungen auf diesem Gebiet weiter. Ich kann dir sagen, wir benützen etliche verschiedene Lösungsmittel und Buffer für die verschiedensten Probleme.
8. Was haben wir zudem gelernt?  Richtig, — Das alle Atlanten, zumindest die UV/Vis-, die NNIR-, und die NIR- Atlanten von äusserst zweifelhaftem Wert sind, da praktisch alle Substanzen in Alkohol, Methanol, Aceton, Hexan, Wasser, oder ähnlichen Lösungsmitteln gemessen wurden, aber nie “pH-justiert”! Man kann sich glücklich schätzen, wenn man mal eine Messung in Anwesenheit von einer starken Säure oder starken Base findet.  Oder, was ist zum Beispiel der Wert einer "Linearität", wenn sich gleichzeitig mit der Konzentration auch die Ionenstärke, die ja selber nichts absorbiert, ändert?
   Wenn Du noch ein schlechtes Beispiel^[2] benötigst, welches das eben gesagte untermauert, muss ich weit zurückgehen in unserer Geschichte (1983), da wir einem solchen Fehler nie wieder verfallen sind.
9. Ein spektroskopischer Effekt, welcher Dir bestens bekannt sein sollte, ist, dass jede Verbindung eine deutliche bis extreme spektrale Abhängigkeit vom verwendeten Lösungsmittel zeigt
   Es gibt, nur vollständigkeitshalber erwähnt, Effekte, welche für Spektroskopiker, missverständlich: 'nonlinear optics' genannt werden. Was aber nicht zwangsläufig ein Nichtbefolgen von Beer-Lambert bedeutet. Solche Effekte wollen wir erst später diskutieren.
10. Nun wird es Zeit den schwierigsten aber wichtigsten Lern-Prozess zu vollziehen, speziell schwierig für all jene Spektroskopiker, welche zeitlebens durch Einwellenlängenmessungen geprägt sind.
    Wir haben den Wechsel vom “Speziellem Beer-Lambert Gesetz”, welches Du in Schritt 1 wieder erlernt hast, zum "Allgemeinen Beer-Lambert Gesetz" zu "verkraften".
    Du fragst mich was ich den noch mehr generalisieren möchte am 'alten' Gesetz?   NICHT ICH will, — WIR SPEKTROSKOPIKER, müssen es tun! Ich selber denke nur, dass es höchste Zeit da für ist!
    Du erinnerst Dich an das “Spezielle Beer-Lambert Gesetz”:
    

    (Sorry, aber ich mag es lieber ein Bisschen exakter!)

    Vergiss es niemals: Beer-Lambert ist nicht definiert, weder bei Deiner Lampe, noch an Deinem Detektor, noch sonst wo, ausser an den beiden Grenzflächen von Deinem Sample, — Verwechsle es niemals !!!
    Nun gestatte uns einen Blick auf das "Allgemeine Beer-Lambert Gesetz":
    
    
    Kannst Du bereits verstehen, was es Dir sagen will? Was Du von nun an für den ganzen Rest von “Deinem Spektroskopikerleben” zu beachten hast!
    Ich kann es zwar nicht glauben, aber lass es uns diskutieren in Lektion 2 !

Epilog to Lektion 1:

Lektion 2: Konsequenzen aus dem “Allgemeinen Beer-Lambert Gesetz”:

Lass uns unsere Diskussion mit den Methodiken der verschiedenen Spektroskopikern beginnen:

	1.)	Was “praktisch jeder” Spektroskopiker tut: cS = cR * ( AS / AR )           (1)   Darin bedeutet:   cS    ist die Konzentration des Samples, welche es zu bestimmen gilt.   cR   ist die bekannte Konzentration der Referenz-Lösung.   AS   ist die "abgelesene" Absorbanze der Sample-Lösung in der Küvette mit Schichtdicke d.   AR  ist die "abgelesene" Absorbanze der Referenz-Lösung in der Küvette mit Schichtdicke d. Dies scheint auf den ersten Blick nicht viel mit dem Gesetz von Beer - Lambert gemein zu haben ! Es mag Dich erstaunen, aber ich werde auf keinen Fall dieser, Deiner Schlussfolgerung widersprechen !!!
	2.)	Was ein “vermeintlich guter” Spektroskopiker zusätzlich tut: Ein vermeintlich guter Spektroskopiker präpariert wenige zusätzliche Verdünnungen mit unterschiedlichen Verhältnissen, aus der Stammlösung der Referenz, oder im besseren Falle präpariert er wenige Referenz-Lösungen mit unterschiedlichen Einwaagen und versucht auf diese Weise eine Art Linearität der Gleichung (1) zu belegen. Wenn er sich für besonders gut hält, versucht er sich sogar im "Vorhersagen" eines vermeintlichen linearen Bereiches mit seinen Grenzen für die Gleichung (1) !
	3.)	Was ein wirklich guter, "moderner" Spektroskopiker (GMS) tun muss: Ein wirklich guter, "moderner" Spektroskopiker (GMS) würde das allgemeine Gesetz von Beer-Lambert auf die Gleichung (1) anwenden, und alle Konsequenzen die sich aus der Interpretation der neuen Gleichung ergeben, für sein weiteres Tun ablesen und — beherzigen! Lass es uns zusammen versuchen:                         (2) STOP !   STOP !  : Das wäre wieder richtig “Spektroskopiker like”, nur die halbe Arbeit tun, und dann jedermann wissen lassen, dass man für das was daraus folgt nicht verantwortlich sei ! Ich — habe gesagt das   “Allgemeine” Beer-Lambert Gesetz:               (3) SO !   Dies ist schon viel besser. Für den Moment kann ich damit leben !: Natürlich ist diese Form mathematisch absolut inkorrekt !   Aber diese Gleichung ist bereits genügend präzise, zum Ablesen/Definieren ALLER Verantwortlichkeiten, welche wir als wirklich gute “moderne” Spektroskopiker haben! Und lass es Dir gesagt sein, dass aus der exakten Formel (3), keine weiteren Verantwortlichkeiten folgen, speziell, da wir die Situation innerhalb der Küvette beschreiben und nicht auf dem aktiven Element des Detektors: (Du wirst es realisieren, wenn wir über die Verhältnisse bei der realen Multi Component Analysis (MCA)[ 4] sprechen !)   In Gleichung (3) bedeutet:   cS    ist die Konzentration der Sample-Lösung, welche bestimmt werden soll.   cR   ist die bekannte Konzentration der Referenz-Lösung.     ist die Konzentration der Komponente i in der Sample-Lösung.     ist der ExtinktionsKoeffizient der Komponente i in der Sample-Lösung.    ist die Konzentration der Komponente j in der Referenz-Lösung.    ist der ExtinktionsKoeffizient der Komponente j in der Referenz-Lösung.      ist die Schichtdicke der verwendeten Küvette. Sie ist meist in Übereinstimmung mit          der “alten” Methodik identisch für Referenz und Sample.      ist die vollständige Anzahl der Komponenten der Referenz Lösung.       ist die vollständige Anzahl der Komponenten der Sample-Lösung.
Für den geneigten Leser, welcher bereits das "Allgemeine Beer-Lambert" Gesetz begriffen hat und ebenso die letzten drei gemachten Schritte, sollte spätestens jetzt klar geworden sein, dass das "Allgemeine Beer-Lambert" Gesetz uns NIEMALS eine obere Grenze für die Linearität setzt !!!!  Im Gegenteil, es ist die Physik selbst, welche uns eine Limite vorgibt was die höchste erreichbare “Konzentration” anbelangt, welche wir in den Lichtstrahl bringen können. !!! Peter Forster Es ist klar, dass es ganz wenige Ausnahmen von dieser Regel gibt. Doch es sind wirklich sehr, sehr wenige, und dann meist von der Art, dass irgend ein spektroskopischer Effekt zu messen versucht wird und schliesslich als Absorption interpretiert wird, was natürlich vollkommen falsch ist. Als typischer Vertreter dieser Art mögen die "Pseudo-Lösungen" gelten, bei denen die scheinbare Absorption zur Hauptsache daher rührt, dass diese "Lösungen" primär Lichtstreuung zeigen und nicht Absorption. Das aber eine unüberschaubare Zahl von Spektroskopikern diesen Effekt von Lichtverlust genau gleich behandeln, wie wirkliche Absorption, kann nur als absoluten Missbrauch des "Beer-Lambert Gesetzes" verstanden werden Vollständigkeitshalber, will ich die Klasse von Verbindungen erwähnen, welche spezielle optische Effekte zeigen aber für uns Spektroskopiker den missverständlichen Namen: “non linear optics” tragen, was nicht zwangsläufig einer Verletzung des "Beer-Lambert Gesetzes" bedeutet, sondern eben einen optischen Effekt bezeichnet. Diese Verbindungen wandeln meist einen Teil des Lichtes oder anderer Energie in Licht einer anderen Wellenlänge um. Trotzdem gilt natürlich auch für diese Klasse das selbe, wie für die "Pseudo-Lösungen"-gesagte. Dies soll jedoch nicht heissen, dass diese Effekte von weniger grossem Interesse wären. Ganz im Gegenteil, nur eben auf einem vollständig anderen Forschungsgebiet !   Peter Forster Zum Schluss sollte klar sein, dass alle Gleichungen welche einen Teil des “nichtlinearen” Bereiches des Beer-Lambert Gesetzes mit einem physikalischen Effekt erklären wollen “Pseudo-Korrelationen” darstellen müssen, da im besten Falle die Korrelation gegen die Konzentration einer gewissen Spezies hätte erfolgen müssen !!! Peter Forster
	4.)	Konsequenzen welche aus Gleichung (3) für einen “wirklich guten, modernen” Spektroskopiker folgen: Der Spektroskopiker muss beweisen, dass  m = vollständig  und  n = vollständig  gilt! Das heisst aber auch, dass selbst das Lösungsmittel in die Rechnung eingehen muss, wenn es in einem Teil des Spektrums eine signifikante Absorption aufweist. Es kann fatale Folgen haben, wenn der Spektroskopiker meint, weil er ein double-beam, double-monochromator Instrument besitzt, er befinde sich auf der sicheren Seite, speziell beim Messen von hohen Sample-Konzentrationen! (Keyword: Linearity bis 4.5 AU's). Ausserdem hat der Spektroskopiker zu beweisen, dass  m = n  gilt ! Noch genauer, er muss beweisen, dass  =   für jeden Index  i = j  gilt ! Mit andern Worten: Er muss beweisen, dass die genau gleichen Verbindungen sowohl im Sample als auch in der Referenz enthalten sind. Dies muss auch gelten, um ja nicht missverstanden zu werden, wenn nach Meinung des Spektroskopiker nur eine Verbindung vorliegen sollte. (Dies stellt einen der am weitaus häufigsten, das Gesetz missachteten Fälle dar!) Das heisst, um exakt zu sein, dass der Spektroskopiker dies bei jedem Sample zu verifizieren hat ! (Sample-Method-Validation lässt grüssen.) In der gleichen Art und Weise muss der Spektroskopiker beweisen, besonders wenn er Spektren speichert, dass: dsample = dreference  gilt ! Ansonsten muss er seine Küvetten kalibrieren und deren Schichtdicken in der Rechnung berücksichtigen ! Bei dieser Gelegenheit: Die Konsequenz welche erfüllt sein muss um die Gleichung (3) in dieser vereinfachten Form mathematisch korrekt werden zu lassen ist: Für jeden Index  i = j  müsste gelten:     = r = const. ! Somit stellt die Gleichung (3) nur einen Spezialfall der exakten, allgemeinen Form der zu verwendenden Gleichung dar ! Übrigens: - Wärst Du fähig die exakte mathematische Form der Gleichung (3) zu erstellen? Versuche es einmal !    Es ist gar nicht so einfach wie man denkt ! (Hint: Wenn Du Matrixen/Vektoren benützt wird es etwas einfacher !)
	5.)	Wie ein “wirklich guter, moderner” Spektroskopiker (GMS) die Anforderungen von Gleichung (3) erfüllt: Bereits zum Beginn der Methodenentwicklung müssen wir zum besseren Verschtändniss unterscheiden zwischen zwei Fällen:   A.)  Wenn “vermeintlich” nur eine “reine” Verbindung vorliegen sollte: Der “wirklich gute, moderne” Spektroskopiker (GMS) präpariert zwei bis drei Stammlösungen leicht unterschiedlicher Konzentration, berücksichtigt aber die später zu erwartende Probenkonzentration. Zusätzlich präpariert er eine Stammlösung mit etwa der zwei- bis drei-fachen Konzentration als unter Punkt 1. Nun präpariert er von jeder Stammlösung acht bis zehn, oder je mehr desto besser, Verdünnungen über einen weiten Konzentrationsbereich ! Als nächstes zeichnet der “wirklich gute, moderne” Spektroskopiker von jeder erstellten Verdünnung das Spektrum auf und speichert es in digitaler Form. Und zwar zeichnet er das jeweilige Spektrum über einen weiten Wellenlängenbereich auf, der auch einen wesentlichen Anteil der Nulllinie beinhaltet! Sollte er jedoch die Aufzeichnung mit mehr als etwa 100 nm / min. vornehmen, wird er spätestens unter Punkt 6 scheitern!!! Als nächstes kann nun endlich die Linearität für jede Verdünnungsreihe einzeln bei der dafür geeignest erscheinenden Wellenlänge erfolgen. Dann werden die einzelnen Verdünnungsreihen untereinander verglichen. Anschliessend plottet der “wirklich gute, moderne” Spektroskopiker (GMS) für jede Verdünnungsreihe alle Spektren für eine vernünftig gewählte Konzentration auf den gleichen Plot, und beweist damit, dass alle Spektren absolut kongruent sind, und sich höchstens im etwas erhöhten Rauschen der niedrig konzentrierten Spektren unterscheiden. Das ist wahre Linearität und wie sie getestet werden muss! Nun da alles in Papierform vorliegt, werden alle Resultate unterzeichnet und zusammengeheftet. Dies ergibt den minimalen Report über die erfolgte Methodenentwicklung. Sollte sich eine gewisse Nichtlinearität zeigen, so liegt die vermeintlich reine Verbindung in nicht nur einer Form vor und es muss das alternative Prozedere angewendet werden !!!!!. Für das ganze Prozedere dieser Methodenentwicklung benötigt der “wirklich gute, moderne” Spektroskopiker nicht ganz eine Stunde ! ! !         ( siehe: Linearitäts Report! [ 5])   (Interesiert es Dich, wie so eine Linearität aussieht?)[5]   B.)  Wenn bekannt ist, dass eine Mischung aus mehreren Verbindungen vorliegt: Niemals benütze er, der GMS, Mischungen für die folgende Methodenentwicklung !!! Glaube keinem "Spezialisten" der Dir einreden will, Mischungen seien besser als reine Komponenten! Er hat absolut unrecht und handelt 1.) falsch und 2.) gegen Beer-Lambert! Falls Du keine Möglichkeit hast an die reinen Komponenten der Mischung zu kommen, benütze ein alternatives Verfahren, welches ich etwas später noch beschreiben werde. (Wenn es sehr eilt, sende mir ein Mail mit der Beschreibung Deines Problems !) Für jede Komponente der Mischung sind die Schritte 5.)A.1 bis 5.)A.6 auszuführen.! Nun präpariere mehrere (mindestens 10) künstliche Samples durch Zusammenpipettieren von unterschiedlichen Volumina's aus den bestehenden Stammlösungen und simuliere so eine gewisse Variabilität in der Zusammensetzung der Proben. Von jeder künstlich erzeugten Probe zeichnet der “wirklich gute, moderne” Spektroskopiker das ganze Spektrum auf (auch elektronisch!) und bestimmt die Wiederfindungsrate für die individuellen Bestandteile der Mischung. Gleichzeitig errechnet er aus den Wiederfindungsresultaten der Einzelkomponenten das theoretische Probenspektrum und beweist bei guter Methodenentwicklung, dass das wirkliche Probenspektrum zum theoretischen absolut kongruent ist! Damit beweist er, dass keine unbekannte “Reaktion” zwischen den Komponenten der Mischung stattgefunden hat! Wenn die Wiederfindungsresultate oder/und die Kongruenz ungenügend ausfallen, ist es ein Zeichen dafür, dass zumindest eine weitere Verbindung (chemischer oder physikalischer Natur) in der Mischung entstanden ist. Somit muss das Modell der Mischung erweitert werden. In den meisten Fällen ist die zusätzliche Verbindung nicht rein erfassbar, und man muss zu einem alternativen aber bekannten Verfahren greifen, wie bereits erwähnt! Wenn die Methodenentwicklung soweit gediehen ist, ist es Zeit wirkliche Samples zu messen und zu belegen, dass in der Methodenentwicklung nichts vergessen wurde ! Ist auch diese Hürde genommen, gilt es alle Resultate zu unterzeichnen und zusammen zu heften ! Das Ganze stellt den minimalen Report für eine solche erweiterte Methodenentwicklung dar ! Dass diese, leicht kompliziertere Methodenentwicklung auch den “wirklich guten, modernen” Spektroskopiker (GMS) etwas mehr Zeit als eine Stunde kosten dürfte, ist sicher leicht einzusehen ! Dieses Prozedere für Mischungen kann durch den Einsatz geeigneter Geräte und Software wesentlich verkürzt und gleichzeitig vertrauenswürdiger, bei wesentlich weniger Stress für den Spektroskopiker, gestalted werden. Wir werden es sehen, wenn wir über “Echte Chemometrie” diskutieren werden.
Von allem auf dieser Seite erläuterten gehen folgende zwei Fakten ganz klar hervor: In Zukunft gibt es für uns “wirklich guten, modernen” Spektroskopiker (GMS) absolut kein excuse mehr, wir sind ab jetzt voll verantwortlich für die korrekte Entwicklung spektroskopisch-analytischer Methoden und kommen auch um eine korrekte Sample-Methoden-Validierung in keiner Art und Weise mehr herum !!!! Es ist ebenso klar, dass wir unserer Verpflichtungen nicht mehr erfüllen können, selbst mit der neuesten Generation von “scannenden” Spektrophotometern !!! Unsere Aufgabe ist nur noch zu erfüllen mit wohl designeten “Diode Array Spectrophotometern” !!! Zudem benötigen wir unbedingt ein Gerät welches sich “ Dynamischer Dilutor” nennt, um all die notwendigen Verdünnungen mit so wenig Lösungsmittel und in so kurzer Zeit zu bewerkstelligen !!!! Doch es muss strengstens darauf geachtet werden, dass es ein echter “Dynamischer Dilutor” ist, ein statischer Verdünner genügt hier bei weitem überhaupt nicht mehr !!! Du kannst Dich glücklich schätzen, denn beide Gerätschaften sind heutzutage leicht erhältlich. Peter Forster
I will soon continue.